公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

保存條件：4℃。
產品介紹：
RNA性質不穩(wěn)定，極易降解。溶解于無RNase的TE 或水中的純化RNA，即便是儲存于-20 oC也難免降解。為解決這一問題，可以將RNA沉淀或RNA溶液溶解于RNA 長期保存液中，允許RNA 4oC保存或-20oC至少保存1年而免于降解。RNA長期保存液是RNA樣品運輸和中長期保存的佳選擇。需要時可用常規(guī)乙醇法沉淀回收RNA，或直接吸取儲存于RNA 溶解保護液中的高濃度RNA(可達4 mg/ml)進行RNA 電泳、Northern Blot。
注意事項：
1. RNA 長期保存液可能抑制逆轉錄酶活性，做 RT-PCR 反應前應該用乙醇沉淀 RNA。
2. 在 RNA 長期保存液中的 RNA 的終濃度不應該超過 4μg /μl。用 RNA 長期保存液溶解 RNA 沉淀：
1. 對固體 RNA 沉淀，每 0.4-4μg RNA 沉淀加入 1μl RNA 長期保存液，反復吹打混勻或者室溫振蕩 15-30 min 溶解沉淀。干燥的 RNA 沉淀難以溶解，可反復吹打混勻后 50oC 加熱 10-15 min。最好先用小體積無 RNase 的TE 或水溶解 RNA 沉淀，然后按液態(tài) RNA 操作。
2. 對液態(tài) RNA 溶液，每 0.4-4μg RNA 溶液加入 1μl RNA 長期保存液，混勻。注意混合液中 RNA 長期保存液的體積百分比不低于 80%。
3. 測定 OD 值。注意加入相應量的 RNA 長期保存液做空白。
4. 將溶解的 RNA 樣品儲存于-20 oC 或者-70 oC。從 RNA 長期保存液中沉淀 RNA：
1. 估計 RNA 溶液終體積。加入 4 倍體積的無水乙醇，混勻。如果溶液體積過小，可加入 RNase free water 稀釋 RNA 溶液,如果溶液中 RNA 含量低于 0.25μg /μl，可加入 5M NaCl(RNase free) 至終濃度 0.2M,混勻后再加入 4 倍體積乙醇。
2. 室溫放置 5 min。
3. 12,000rpm 離心 5 min,棄上清,風干，溶解。
4. 重新沉淀的 RNA 溶解后可用于 RT-PCR 反應。也可用于任何其他實驗。直接使用 RNA 長期保存液中的 RNA：直接吸取 RNA 長期保存液中的 RNA，進行普通或甲醛變性電泳和 Northern Blot。進行甲醛變性電泳時，最后上樣的樣品中的 RNA 長期保存液的濃度可高達 50%。
附：甲醛變性電泳樣品準備： 臨用前，混合水（87μl），甲醛（81μl），50%甘油/含 0.25 mg/ml 溴芬蘭(48μl ) 和20X MOPS (24μl). 將上述混合液和 RNA 長期保存液中的 RNA 樣品等體積混合，55 oC 溫育 10 min，按照標準的甲醛變性電泳過程上樣。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。

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